работа

Московский Государственный Университет

им. М. В. Ломоносова.

Факультет биоинженерии и биоинформатики

Щербинин Дмитрий Сергеевич

Компьютерная аннотация
стрептомицинового оперона бактерий

Курсовая работа

Научный руководитель:

Рассохин Т. И.

Москва

2003 г.

Аннотация

Стрептомицин - антибиотик, образующийся в процессе жизнедеятельности лучистых грибов Streptomyces globisporus streptomycini или других родственных микроорганизмов.

Стрептомицин обладает широким спектром антимикробного действия. Антибиотик активен в отношении микобактерий туберкулеза, а также большинства грамм-отрицательных бактерий (кишечная палочка, палочка Фридлендера, палочка инфлюэнцы, возбудители чумы, туляремии, бруцеллеза) и некоторых грамм-положительных (стафилококки) микроорганизмов; менее активен в отношении стрептококков, пневмококков. Не действует на анаэробы и риккетсии. Действует стрептомицин бактерицидно. Эффект связан с подавлением синтеза белка на рибосомах. Наиболее серьёзным препятствием при лечении туберкулёза - возросшая первичная (исходная) лекарственная устойчивость возбудителей заболевания: в 3 и более раза по сравнению с 60-ми годами; инфицирование населения микобактериями, приобретшими резистентность в процессе лечения. [1]

Введение

В структуру стрептомицинового оперона E. coli
входят гены рибосомных белков малой субчастицы S12 (rpsL) и S7 (rpsG), транляционных факторов EF-G и EF-Tu. Белок S7 является регуляторным белком стрептомицинового оперона. При отсутствии свободной рРНК в клетках E.coli
белок S7 связывается с межцистронным участком S12-S7 и ингибирует синтез белков стрептомицинового оперона [2-4] (Рис. 1). Длина межцистронного фрагмента между стоп-кодоном белка S12 и старт-кодоном белка S7 – около 100 нуклеотидов.

Рис. 1.
Модель вторичной структуры межцистронного фрагмента S12-S7 E
.
coli
.

Фенотипическая устойчивость E. coli
к антибиотику стрептомицину обеспечивается мутациями в гене белка S12. Поскольку стрептомицин является важным терапевтическим агентом в медицине и ветеринарии, изучение регуляции синтеза белков стрептомицинового оперона и филогенетический анализ известных бактериальных оперонов является актуальной проблемой. При общей высокой степени гомологии между рибосомными белками в различных организмах размеры и нуклеотидный состав межцистронной области, ответственной в E. coli
за регуляцию экспрессии генов оперона отличаются. Выявление общих закономерностей и установление основных регуляторных районов в стрептомициновых оперонах необходимо для полного понимания процесса регуляции и разработки новых терапевтических агентов.

Цель данной работы – определить, является ли такой механизм аутогенной регуляции белком S7 собственного синтеза уникальным для E
.
coli
, или же существуют бактерии со схожим механизмом.

Материалы и методы

1. Построение выравнивания всех известных рибосомных белков S7 эубактерий, определение позиции старт-кодона.

В системе SRS (http://srs.ebi.ac.uk) найдены нуклеотидные последовательности изученных эубактерий*:

Actinobacteria
; Aquificiales; Cyanobacteria; Cytophagales; Spirochagales; Chlamydiales;
Thermotogales; Thermus (Deinococculus); CFB(Green sulfur); Green non-sulfur;

Pasteurellaceae; Salmonella
; Pseudomonas
; Emterobacteriaceae
; Rhodospirillaceae; Sphingomonadaceae; Rhodobacter
; Rhizobiaceae
; Ricketsiales
; Caulobacter; Bordetella;

Neisseria
; Burkholderia; Bacillus
; Clostridium
; Staphylococcus
; Heliobacterium; Mollicutes
; Streptococcus
; Enterococcus
.

Жирным шрифтом выделены найденные и использованные в работе геномы бактерий.

a) Для поиска был выбран банк EMBL.

b) В окне “Organism name” были поочерёдно введены названия соответствующих групп эубактерий (см. список бактерий)

с) В окне “Features: Gene” было введено rpsG,

d) В другом, таком же окне было введено rpsL (для того, чтобы в найденных последовательностях был не только ген белка S7, но и S12)

Записаны позиции (начало и конец) гена rpsG, учитывая, что среди найденных последовательностей могут быть как прямые (rpsL расположен до rpsG), так и комплементарные (rpsL расположен после rpsG). Для построения комплементарных последовательностей использована программа Revseq из пакета EMBOSS.

2. Экстракция нуклеотидных последовательностей области слева от старт-кодона белка S7, построение выравнивания полученных межцистронных фрагментов.

При помощи программы CutseQ из найденных последовательностей был выделен участок, отстоящий от начала rpsG на 200 нуклеотидов (т.к. близкие к str
оперону E
. с
oli
участки могут находиться как между генами S7 и S12 белков, так и в конце гена rpsL).

Используя программу Alibee

(http://www.genebee.msu.su/serv
ices/malign_reduced.html), построено выравнивания полученных участков (межцистронный фрагмент + часть rpsL)

3. Систематизация, сортировка и аннотация найденных межцистронных фрагментов.

С помощью программы GeneDoc были построены выравнивания межцистронных областей семейств бактерий в сравнении с межцистронным фрагментом E
. coli
.

4. Построение филогенетического дерева эубактерий.

Исходя из полученных выравниваний белков S7 и межцистронных областей бактерий построены филогенетические деревья эубактерий. Для выполнения данной задачи была использована программа, расположенная на сайте http://www.genebee.msu.su/services/phtree_reduced.html

Результаты и обсуждение

В системе SRS (http://srs.ebi.ac.uk) найдены все известные геномы эубактерий. Найденные последовательности были систематизированы и унифицированы по ориентации.

При помощи программы Alibee (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html) было построено общее выравнивание всех найденных последовательностей генов белка S7, а также участков между генами S12 и S7. При помощи этой же программы было построено филогенетическое дерево бактерий (Рис. 2, 3).

При помощи программы GeneDoc были проанализированы полученные выравнивания нуклеотидных последовательностей участков S12 - S7 белков бактерий, относящихся к одной филогенетической группе и последовательность такого же участка генома E. coli.
Выравнивание позволяет найти у изучаемых последовательностей участки, гомологичные фрагменту стрептомицинового оперона E. coli.

Рис. 2.
Филогенетическое дерево эубактерий, построенное по белку S7

Рис. 3.
Филогенетическое дерево эубактерий, построенное по межцистронному фрагменту S12-S7.

В филогенетическом дереве, построенном по белку S7, бактерии располагаются в соответствии с их родственными связями. По построенному же по межцистронным участкам видно, что бактерии можно зразделились на 2 группы:

1) Представители, имеющие соответствующие участки, близкие к E
. с
oli
.

2) Бактерии, проявляющие значительную вариабельность данных межцистронных участков.

Найденные и использованные в работе геномы бактерии

MLB1790G-

Mycobacterium leprae

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.

MLEPRTN7-

Mycobacterium leprae

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.

MTV040-

Mycobacterium tuberculosis H37Rv

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium;

Mycobacterium tuberculosis complex; Mycobacterium tuberculosis.

MSRPSLG-

Mycobacterium smegmatis

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.

SRU60191-

Streptomyces roseosporus

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Streptomycineae; Streptomycetaceae; Streptomyces.

AE014733-

Bifidobacterium longum NCC2705

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales;

Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium; Bifidobacterium longum.

AE009147-

Agrobacterium tumefaciens str. C58 (U. Washington)

Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae;

Rhizobium; Agrobacterium tumefaciens; Agrobacterium tumefaciens str. C58.

AY099291-

Rhodobacter capsulatus

Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales;

Rhodobacteraceae; Rhodobacter.

AE014017-

Buchnera aphidicola str. Bp (Baizongia pistaciae)